徕卡显微镜STED样品制备与快速指南

指导的重点设置 Leica TCS SP8 STED 3X 与592 and 660nm STED激光

受激发射损耗（STED）显微镜是基于荧光共焦成像，其中图像是通过扫描形成聚焦光点在感兴趣的区域，并且通过像素收集的荧光顺序像素获得的超分辨率方法。该技术的主要优势有：

1. 横向分辨率没有任何额外的后处理低于50 nm涡流环室

2. 内在的共焦光学切片，用涡甜甜圈时，使收购约500纳米的平面，三维结构，甚至几十微米深层组织内的

3. 使用z轴分辨率低于130 nm甜甜圈

4. 到水平和分辨率提高空间分布于感兴趣的样品/应用单独匹配的能力

5. 每秒几个图像的快速图像采集

6. 通过使用荧光蛋白或其他荧光标记活的成像能力

7. 能够选择的荧光在很宽的光谱范围由几个不同的激光器受激发射损耗在一台仪器启用

• 受激发射损耗可以在一个大的各种样品的应用，从单一培养的扁平细胞，组织切片，以整体动物，如线虫（线虫）和昆虫（果蝇）。尽管如此几点应该加以考虑。受激发射损耗应用专门开发的受激发射损耗100X /1.4油浸物镜，其中有90微米的工作距离。因此，所观察到的结构应该是至多80微米远离护罩玻璃，但优选在20μm的范围内以获得性能。另外，为了达到的效果，在安装介质的折射率应当与所使用的浸没的索引（浸渍液=1.518，也见步骤5）。目前在我们的投资组合干浸的物镜。

• 该结构必须是光学上可访问的。自发荧光，折射率的突然和不可预测的变化（如含有空气，髓鞘和脂肪组织）可影响焦斑的形状和显微镜的结果的性能。如果与结算解决方案的经验是可用的，它可能是值得的测试。

• 在STED成像，样品在592纳米或660纳米的波长照射强光。这是该试样没有在这些波长处吸收光至关重要。

有一个广泛的徕卡STED显微镜表现良好的荧光基团（如见附录A）。为了达到几个小时，在这一个系统示范正常范围内实现了令人满意的结果，是留在荧光徕卡提出的保留节目。如果这是不可能的，荧光团应选择，它们具有相似的激发和发射光谱的建议染料。这也有利于入手单色染色和，一旦这些被批准，转移到多色实验。请参阅附录B和C的推荐荧光体组合多色实验，它不需要额外的光谱分离。对于受激发射损耗，以提高工作效率，无论是荧光的发射光谱需要显示的受激发射损耗波长显著发射（见例之星440SX和俄勒冈绿488在下面的图）。

为了分析给定样品中的受激发射损耗的性能，该试验被地划分成两部分。 A部分和B可能并行执行，其中A为对照实验二

A) 在根据环境评价的STED性能
荧光染料和抗体是明智的周围环境（pH值，盐浓度，氧化还原试剂）。为了从给定的样品检查染料的性能，在步骤中，一个*的初级抗体，应选择，给出了一个具体的，明亮的染色。即使没有实际的生物相关性，此步骤有助于确保将染料按预期在周围环境中。

B）与所述感兴趣结构工作

在第二步骤中，在技术上更为苛刻染色可以成像，现在针对所感兴趣的实际结构。

标记密度起着超分辨率重要的作用，但它不能被正确地与常规的显微镜检查。通常，在染色过程中，增加抗体浓度已有助于提高样品质量。因此，建议具有较高的抗体浓度（2〜5倍）的受激发射损耗成像合作，以确保标记密度。

明智的做法是测试不同的小学和中学染料浓度在步骤A和B染色的质量（亮度/背景），应检查并有可能使用之前STED成像传统的显微镜进行了优化。

在抗体染色程序执行的每个动作对样品的质量有显着影响。每个步骤将细胞培养用标准免疫荧光协议的方式来简单地说明，作为一个例子中的化步骤为他/她自己的协议，以帮助用户：

试剂
•磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH值7.4
• 在PBS中的2％多聚甲醛（PFA）
• 1％ Triton的PBS
• 牛血清白蛋白（BSA）

过程
所有的步骤都是在室温下进行,评论是在括号中。

1. 冲洗3次，用PBS
   （细胞应洗涤，培养基由几次漂洗培养除去。组织应解剖并从部件可能妨碍图像采集洗净，用建立的实验室协议，如果它们是已知的工作。样品必须轻轻地和快速地处理，这本来会导致过早死亡和分解。）

2. 在PBS中进行15分钟固定与2％ PFA
   （样品固定在样品制备中的关键步骤，因为它定义了如何很好的结构将被保留。随着分辨率这个步骤变得更加重要，应小心处理。PFA是一种常见的固色剂，但它并不总是表现之一。这里可能需要一些研究在文献和优化。替代地，温育5分钟，用冰冷的（-20℃）100％甲醇中可以使用的甲醇固定不需要额外的通透性的步骤，因此，步骤5和6可以用甲醇固定被忽略，也参见下文）。

3. 冲洗3次，用PBS
   (删除更高浓度的固定液为以下步骤)。

4. 与PBS洗涤3次进行5分钟
   (删除其余的固定液以下步骤)。

5. 在PBS 10分钟通透与0.1％的Triton
   （关键步骤以显示表位的抗体。较低浓度/短的孵育时间可更好地保持了结构，但妥协标记密度，较高的浓度/较长的孵育时间可能使表位更容易获得的抗体，但也恶化的结构。某些固定剂（如甲醇），不需要额外的通透步骤。）

6. 与PBS冲洗3倍
   （去除渗透剂。）

7. 在PBS中的2％BSA的1小时
   （阻断可以用不同的试剂来进行，通常由结合于非特异性结合伴侣，否则将结合的抗体与增加的荧光染料的非特异性标记的惰性蛋白质，也是用封端剂而与抗体孵育作为血清有助于保持细胞结构，较厚的组织，可能需要较长的培养时间。）

8. 孵化与抗体进行1小时
   （用较高的抗体浓度可能是受激发射损耗试验很有帮助，潜伏期较长时间经常给出更好的结果，但要注意可能增加的背景下，在较厚的样品（如全坐骑）潜伏期可能长达几天，或者潜伏期可以做到在4℃下过夜）。

9. 与PBS洗涤3次进行5分钟
   （洗涤步骤是重要的，使用高浓度的抗体，尤其是当5分钟为单位的最小的洗涤步骤，在这里，否则转移到10或20分钟的孵育和更多次获得更好的结果上漂洗步骤可能加快该过程。）

10. 孵化与二次抗体进行1小时
    （您可能需要采用/优化抗体浓度为您的应用孵化与二次抗体应该进行类似的一抗孵育二抗一个良好的起点是1稀释：100，从商业来源的时候买的，否则，5×比推荐的稀释更高对于贝克顿迪金森和V500染色使用化的抗体从杰克逊免疫研究实验室以1稀释度：100在这个步骤中温育，也可以一蹴而就较厚的组织需要较长的培养时间）。

11. 与PBS洗涤3次进行5分钟
    (删除 从样本的抗体。 更长、更洗步骤将提高质量和特异性的荧光标签。 以前的清洗步骤可能加速这一过程。)

12. 额外的步骤只需要与BD V500染色时:
    •孵化与Streptavidin-V500 30分钟
    (额外的步骤当BD V500用于荧光标记。 稀释的V500应该1:50。 可能需要更长时间孵化项目心脏组织。)
    •清洗与PBS 3 x 5分钟
    (删除释放Streptavidin-V500从样本。 更长、更洗步骤将提高质量和特异性的荧光标签。 以前的清洗步骤可能加快进程。)

13. 安装
    (见下面的步骤5)

14. 存储在4°C

最后,染色应该清晰和明亮,当通过目镜观察时(如592年发生的:GFP设置单一的颜色,或CFP / YFP设置双颜色与标准和大斯托克斯位移染料)和产量好信号噪声在共聚焦或宽视场荧光显微镜。

该安装介质应具有的折射率匹配，以使穿透深度没有令人不快的畸变所要求的目标的浸渍。此外，没有自发荧光应与592纳米或660纳米的激光照射时，可以观察到，也不应含有DAPI或Hoechst公司（为592毫微米STED）。或者，如果DNA /细胞核染色要求，PicoGreen（Invitrogen）中被发现与两个592纳米和660纳米STED表现良好。

在某些情况下，安装的介质影响的大的斯托克斯位移染料的荧光量子产率（例如的Vectashield），或荧光蛋白和一些绿色染料（如TDE - 染料在TDE工作请参阅施陶特等人的列表，2007）。因此，我们不与大Stoke's移染料推荐的Vectashield的利用起来。延长黄金（Invitrogen公司）也表现良好在我们的手中，并建议由徕卡。

非常良好的结果也与相当简单的自制甘油基于安装获得如下所述：

1. 甘油
   通过结合不同数量的水(PBS)和甘油(甚至只是纯甘油)折射率(RI)可以精确调整在1.33和1.47之间。 此外,它很容易准备,适合长样本存储在-20°C。

2. Mowiol
   6克的甘油(分析纯),加入2.4克Mowiol粉(Calbiochem # 475904),6毫升水的桌子,12毫升0.2三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值8和搅拌大约4小时的解决方案。 随后让解决方案其他额外的2小时。 孵化Mowiol 10分钟50°C(水浴)和离心机的解决方案在5000克15分钟。 最后,把上层的冻结存储介质在-20°C。 Mowiol是迄今为止介质发生的图像,可用于-20°C存储的样本。

所有徕卡物镜与盖玻片校正修正为1.5 #盖玻片(优:0.170±0.01毫米厚,Hecht-Assistent,猫。 1014/2424),数量应该用于安装和大大提高图像质量而发生的# 1盖玻片不仅也为共焦成像。

常见的不变色,例如DABCO(2.5%)或核计划组(4%),也可能导致重大改变所使用的染料和有时photo-physical属性发生的。

徕卡TCS SP8 STED3X模块目前仅支持倒置显微镜代表和现场成像程序，必须做相应的调整。良好的结果已经报告了一系列荧光蛋白。

但是，用于标记活体细胞（如微管蛋白跟踪绿，俄勒冈绿BABTA）也有机染料是有说服力的。

如果实时成像实验需要的话，是直接从徕卡人员以澄清的实验步骤，并且如果必要的设备出现在现场。