SYTO 9产品介绍：
SYTO 9活细菌/死细菌双染试剂盒使用方法(以下步骤仅用作示例以指导科研人员开展自身细菌样本的染色。)
一、培养条件和细菌悬液的制备：
【注意】：用本试剂盒进行细菌染色，务必要小心去除培养基残留，因为，核酸和其它培养基成分可能以不可预料的方式与SYTO 9和PI结合，导致染色结果发生不可接受的变动。简单的一次清洗步骤通常足以去除培养基内含的培养基成分干扰物残留。不建议使用磷酸盐清洗缓冲液，因此可能降低染色效率。
1.1 用营养肉汤培养大肠杆菌或Staphylococcus aureus（30ml）使其生长至对数生长后期。
1.2 于10000×g离心10-15min，浓缩25ml细菌培养物。
1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或适当缓冲液来重悬沉淀。
1.4 取1ml重悬菌液分别加入含20ml 0.85% NaCl或适当缓冲液的30-40ml离心管（设置为活细菌组），用含20ml 70%异丙醇（也可以用其他方法比如高热处理杀死细菌）的30-40ml离心管（设置为死细菌组）。
1.5 两管样品（分别为活细菌组和死细菌组）于室温孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次。
1.6 两管样品（分别为活细菌组和死细菌组）于10000×g离心10-15min。
1.7 用20ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬沉淀，并且按照步骤1.6再离心一次。
1.8 分别用10ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬两管样品。
1.9 分别取3ml菌液测定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路径）。
1.10 对于大肠杆菌或Staphylococcus aureus的建议染色浓度，根据你的仪器类型（荧光显微镜、荧光光度经、荧光酶标仪）或流式细胞仪来参考相应部分的染色条件。
二、染色条件的优化：
试剂盒内的两种染料都经过平衡优化，按照1：1的比例进行混合用于绝大多数的样本都能得到良好的区分活/死细菌。偶然情况下，两种染料的混合比例需根据实际需求进行优化调整。比如：在待检样本中，绿色荧光太突出，建议要么降低SYTO 9浓度，要么提高PI浓度。
为了全面优化染色条件，建议测试梯度浓度的SYTO 9，每一种浓度与梯度浓度的PI进行组合染色。建议按照1ml细菌悬液加入3?l不同混合比率的染料预混液。
[注]：SYTO 9 +PI 对细菌的染色请按照说明书建议的15min来操作，不要超过30min。 SYTO 9有很好的细菌渗透性，我们给的实验条件都是优化过。 SYTO 9只有在哺乳动物细胞染色，可能会延长染色时间到120min。
由于染的是活菌+死菌的比例，请染色后尽快观察，不要超过1h。 另，染色后基本是不用清洗的，除非觉得背景荧光很高，就是非细菌的菌体部分都能看到荧光，才有必要简单清洗一次。
