反相色谱流动相的选择

反相洗脱溶剂强度：（强度因数S）

1.二元流动相：水为底剂，加入一定比例的与水混溶的有机极性调节剂（甲醇、乙腈）

2.多元流动相：

 a.对于难分离的物质，可以尝试加入一定比例洗脱强度不同的有机溶剂，如：异丙醇、四

氢呋喃等

 b.当色谱峰拖尾时，可加入有机碱类扫尾剂，如：三乙胺

3.减小残留硅羟基对分离的影响可采取以下措施：

 a.流动相中加入三乙胺等硅羟基的竞争性试剂，减小拖尾。

 b.改变流动相的pH值（根据色谱柱和样品的性质）。

 c.EDTA去除金属杂质

 d.利用盐效应减弱残存硅羟基的干扰

反相色谱流动相选择

按照溶剂会影响选择性的特征（包括酸性、碱性、偶极性等）选用不同的RPC溶剂。

不同的溶剂可依据这些特性来分类，以甲醇、乙腈、四氢呋喃为代表溶剂，对于实际方法建立的意义在于：一般只需选择这三种溶剂，即可将选择性达到分离要求。

下图阴影区域为MeOH、ACN、THF的选择性

非极性、非离子化合物的RPC保留规则：

弱非键合硅胶＜＜氰基＜C1（TMS）＜C3 ＜C4＜苯基＜C8≈C18（强

Opalshell-C18  应用——化工及制药中间体

溶剂类型的选择

非离子化样品，实验条件对选择性改变的相对大小影响排序：

温度＜有机相比例＜溶剂类型≈色谱柱类型

上图显示为反相HPLC 色谱法溶剂强度列线图

下图为反相流动相组份UV吸收值与波长的关系

反相离子抑制色谱流动相的选择：

通过调节流动相的pH值，抑制样品解离，增加样品在固定相中的溶解度，以达到分离弱酸和弱碱的目的。

分离弱酸（3.0≤pKa≤7.0）和弱碱（7.0≤pKa≤8.0）时，可用离子抑制色谱法。

离子抑制剂：弱酸（1%醋酸、TFA）、弱碱（1%氨水）、缓冲盐（磷酸盐、乙酸盐）

•流动相pH对反相保留的影响与样品类型（酸、碱、中性）的关系

当某种酸（HA）和碱（B）发生解离（即从不带电形式转化），其疏水性将会大大减弱（亲水性增强）。因此，在RPC中的保留值k可能下降10~20倍

当pH增加，酸失去质子（发生解离）；而当pH降低时，碱获得质子（也发生解离）；因此随pH增加，酸的RPC保留值减小，而碱的则增大。

流动相选择：

反相离子对色谱流动相的选择：

在流动相中加入与被测离子相反电荷的离子对试剂，使之形成中性的离子对化合物，从而增加样品离子在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，分离改善。分配系数的大小主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂的浓度。

分离机理以RPIC分离碱类物质为例，用离子对模式说明分离机理

•分离pKa<3.0的酸及pKa>8.0的碱时，采用离子对色谱法。

•分析碱性样品常用离子对试剂：烷基磺酸盐（庚烷磺酸钠）

•分析酸性样品常用离子对试剂：季铵盐（四丁基氢氧化铵）

1.离子对试剂浓度：0.003～0.01mol/L

2.调节pH值，改变分离选择性

3.柱温改变分离选择性，检测过程中******温度恒定。

离子化样品，实验条件对选择性改变的相对大小影响排序：

缓冲液浓度与种类＜温度＜有机相比例＜溶剂类型≈色谱柱类型＜pH

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